Sự chia cắt của Triều Tiên sau hơn một thiên niên kỷ thống nhất, được xem là tình trạng đang tranh cãi và tạm thời bởi cả hai chính quyền. Từ năm 1948 cho tới đầu cuộc nội chiến ngày 25 tháng 6 năm 1950, lực lượng vũ trang của mỗi bên tham gia vào một loạt các xung đột đẫm máu dọc theo biên giới. Năm 1950, những xung đột này leo thang đột ngột khi lực lượng CHDCND Triều Tiên xâm lược Hàn Quốc, gây ra Chiến tranh Triều Tiên. Liên Hợp Quốc đã can thiệp để bảo vệ miền Nam, gửi đến một lực lượng do Hoa Kỳ lãnh đạo. Khi đã chiếm được miền nam, CHDCND Triều Tiên đã cố gắng thống nhất Hàn Quốc dưới chế độ của nó, bắt đầu quốc hữu hóa công nghiệp, cải cách ruộng đất, và khôi phục các Uỷ ban Nhân dân.[42]

Mặc dù sự can thiệp của Liên Hợp Quốc đã được hiểu là để khôi phục lại biên giới tại vĩ tuyến 38, Syngman Rhee lập luận rằng cuộc tấn công của miền Bắc đã xóa bỏ ranh giới. Tương tự Tổng tư lệnh quân đội Liên Hợp Quốc, Đại tướng Douglas MacArthur tuyên bố ông muốn thống nhất đất nước Triều Tiên, chứ không chỉ là đẩy lui các lực lượng Triều Tiên về phía bên kia biên giới.[43] Tuy nhiên, miền Bắc đã chiếm được 90% miền Nam cho tới khi một cuộc phản công do Hoa Kỳ lãnh đạo diễn ra. Khi lực lượng Triều Tiên bị đuổi khỏi miền Nam, lực lượng Nam Triều Tiên đã vượt qua vĩ tuyến 38 vào ngày 1 tháng 10, và quân của Hoa Kỳ - Liên Hợp Quốc tiến đến sau đó một tuần. Điều này bất chấp những cảnh báo từ Cộng hoà Nhân dân Trung Hoa rằng họ sẽ can thiệp nếu quân đội Mỹ vượt qua ranh giới song song - vĩ tuyến 38.[44] Khi đã chiếm được miền Bắc, Hàn Quốc cố gắng thống nhất đất nước dưới chế độ của họ, với Cảnh sát quốc gia Hàn Quốc thực thi việc tuyên truyền chính trị.[45] Khi lực lượng Hoa Kỳ tiến tới phía bắc, Trung Quốc đã phát động một cuộc phản công và đẩy họ trở lại miền Nam.

Năm 1951, khi tiền tuyến ổn định gần vĩ tuyến 38, và cả hai bên bắt đầu xem xét về một cuộc đình chiến. Tuy nhiên, Rhee đã yêu cầu chiến tranh tiếp tục cho đến khi Triều Tiên được thống nhất dưới sự lãnh đạo của ông.[46] Phía Cộng sản đã ủng hộ một đường biên giới dựa trên vĩ tuyến 38, nhưng Liên Hợp Quốc ủng hộ một đường biên giới dựa trên lãnh thổ của mỗi bên, có sức thuyết phục hơn, và đường biên giới này đã chiếm ưu thế.[47] Thỏa thuận Đình chiến của Triều Tiên đã được ký sau ba năm chiến tranh. Hai bên đã đồng ý tạo ra một vùng đệm rộng bốn km giữa hai quốc gia, được biết đến là Khu phi quân sự Triều Tiên (DMZ). Biên giới mới này phản ánh lãnh thổ của mỗi bên khi chiến tranh kết thúc, vượt qua đường vĩ tuyến 38 theo đường chéo. Rhee từ chối chấp nhận đình chiến và tiếp tục thúc giục việc thống nhất đất nước bằng vũ lực.[48]

Mặc dù cả hai bên đã nỗ lực để thống nhất đất nước, cuộc chiến đã kéo dài sự phân chia Triều Tiên và dẫn tới một liên minh vĩnh viễn giữa Hàn Quốc và Hoa Kỳ, và một lực lượng thường trực của quân đội Hoa Kỳ ở miền Nam.[49]